标准集团（香港）有限公司：由中国材料与试验标准化委员会科学试验标准化领域委员会科学试验创新方法标准化技术委员会(CSTM/FC98/TCO2)归口承担的《玉米褪绿斑驳病毒形态学检测透射电子显微镜法》团体标准(立项号:CSTM LX 980200999—2022)已完成征求意见稿，按照《中关村材料试验技术联盟团体标准管理办法》的有关规定，现公开广泛征求意见。

　　玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus, MCMV)是侵染玉米的重要检疫性病毒病原，被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。该病毒与马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的几种病毒之一复合侵染引起的玉米致死坏死病(corn lethal necrosis，CLN)，是玉米生产的毁灭性病害，一旦发生将带来严重的经济损失。MCMV为直径30nm的二十面体对称球状粒子，可经汁液、介体叶甲和蓟马传播，田间扩散容易，在病毒分类学上归属于类番茄丛矮病毒目(Tolivirales)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)(附录A)。应用透射电子显微镜可观察其形态结构以及细胞病理学特征，是验证抗体检测和分子检测结果的重要形态学检测依据。

　　透射电镜为大型精密仪器，技术要求较高，用透射电镜技术检测植物病毒虽然广泛应用于高等院校、科研院所、检验检疫机构，但由于各个电镜实验室技术能力的差异，在具体操作上缺少统一标准，往往造成检测结果差别很大。迄今为止还没有一个国家或者行业标准可用于规范MCMV的电镜检测分析，我们也没有查到相应的国际标准。因此，有必要先制定一部规范MCMV透射电镜形态学检测诊断的团体标准，把关键的样品前处理程序以及电镜判定标准确定下来，以保证检测结果的准确性和科学性。

　　本文件参照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》，GB/T 20001.4《标准编写规则 第4部分：试验方法标准》给出的规则起草。参考SN/T 2964-2011 植物病毒检测规范；SN/T 2122-2015 进出境植物及植物产品检疫抽样；GB/T 31810-2015 玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法等规程编制。

　　本文件规定了应用透射电子显微镜对玉米褪绿斑驳病毒进行形态学检测的方法。本文件适用于玉米褪绿斑驳病毒的检验检疫与鉴定。

　　方法原理：

　　负染色技术原理：采用高密度的重金属盐染色液(如磷钨酸、醋酸双氧铀等)包围低密度的样品颗粒，使样品颗粒周围的电子密度得到增强，在透射电镜下显示暗背景衬托的浅色样品颗粒形态及微细结构，图像呈现负反差。该方法直接对病毒悬液样品进行负染色，操作简便，可用于病毒快速检测。

　　免疫电子显微术原理：免疫电子显微术分为免疫复合物电镜技术和免疫标记技术两大类。免疫复合物电镜技术是对电镜载网上形成的抗原抗体免疫反应复合物进行负染色后电镜观察，适用于病毒快速检测诊断。免疫标记技术是以抗体连接标记物(如胶体金)作为探针，对细胞表面或细胞内部的相应抗原进行定位、定性及定量测定。

　　超薄切片技术原理：将经过固定的生物样品样包埋在树脂介质中，采用超薄切片机将聚合的样品包埋块切成厚度为50 nm~100 nm的薄片，在透射电镜下观察细胞内病毒分布及细胞病理变化。

　　仪器设备：

　　1.透射电子显微镜；2.超薄切片机；3.玻璃制刀机；4.超薄切片钻石刀；5.高速离心机；6.正置光学显微镜；7.研钵；8.微型研磨器；9.涡旋振荡仪；10.辉光放电仪；11.移液器(20μL、200μL)。

　　环境条件：

　　超薄切片机、透射电镜应安装在独立的房间内，工作环境应符合以下要求：a) 超薄切片机：相对湿度小于60%，温度(20±5)℃，电源电压(220±22)V，电源频率(50±1)Hz，满足防震要求。

　　b) 透射电镜：相对湿度小于60%，温度(20±5)℃，电源电压(220±22)V，电源频率(50±1)Hz，具备仪器专用地线，接地电阻值参照仪器说明书的要求。

　　试验数据处理：

　　MCMV的透射电镜形态学检测结果以图像形式保存，病毒粒子形态与大小尺度符合附录A和附录C的特征数据。线粒体的囊泡化及纤维状内含物、过氧化物酶体外膜周边小泡等细胞病理学特征为MCMV所特有，可作为形态学检测诊断依据之一。

　　检测结果发布：

　　检测结果报告应包括以下信息：a)检测报告的编号；b)样品名称；c)送样人姓名、单位和地址；d)样品的接收日期；e)检测仪器及其工作条件；f)检测结果和必要的说明；g)检测人签字；h)检测报告负责人签字；i)检测报告的页码；j)发布检测报告的实验室名称和地址；k)检测报告的日期。

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