凝胶色谱柱操作-标准集团(香港)有限公司
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公司起步于纺织领域的开发,秉持专业、真诚、热情、高效的服务理念,全面贴近客户需求,获得客户高度认可。一直以来,我们始终坚持提供适用产品,依赖专业高效的服务团队,整合技术和资源优势,为客户解决科研生产中遇到问题提供支持,从而带动国内科研及相关行业水平的提高。通过个性化的售前产品咨询,高效率的售后安装、维护和维修,标准集团正越来越多赢得市场和客户的信赖。
1、溶胀商品凝胶是干燥的颗粒,通常以40~63um的使用多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天,如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸,则溶涨时间可以缩短到1~2小时。凝胶的溶涨一定要完全,否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。
2、装柱
由于凝胶的分离是靠筛分作用,所以凝胶的填充要求很高,必须要使整个填充柱非常均匀,否则必须重填。凝胶在装柱前,可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质,并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱,在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定,加入少量流动相以排除柱中底端的气泡,在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗,颈直径约为柱颈的一半,然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液,同时打开色谱柱的毛细管出口,维持适当的流速,凝胶颗粒将逐层水平式上升,在柱中均匀地沉积,直到所需高度位置。拆除漏斗,用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面,再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。
3、柱均匀性检查
凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀,在对样本运行分离之前,对色谱柱必须运行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的,检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯,用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等,加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围,如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整,即说明色谱柱性能良好;如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。
4、上样
凝胶柱装好后,一定要对柱用流动相运行很好的平衡处理,才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素,总的原则是要使样本柱塞尽量的窄和平整。为了防止样本中的一些沉淀物污染色谱柱,一般在上柱前将样本过滤或离心。样本溶液的浓度应该尽可能的大一些,但如果样本的溶解度与温度有关时,必须将样本适当稀释,并使样本温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后,这时可打开色谱柱的活塞,让流动相与凝胶床刚好平行,关闭出口。用滴管吸取样本溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中,打开流出口,使样本液渗入凝胶床内。当样本液面恰与凝胶床表面平时,再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此,每一次的关键是既要使样本恰好全部渗入凝胶床,又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量运行洗脱。整个过程一定要仔细,避免破坏凝胶柱的床层。
5、冲洗
凝胶色谱的流动相一半多采用水或缓冲溶液,少数采用水与一些极性有机溶剂的混合溶液,除此之外,还有个别比较特殊的流动相系统,这要根据溶液分子的性质来决定。加完样本后,可将色谱床与洗脱液贮瓶及收集器相连,设置好一个适宜的流速,就可以定量地分布收集洗脱液。然后根据溶质分子的性质选择光学、化学或陶粒滤料学的方法运行定性和定量测定。
6、再生
因为在凝胶色谱中凝胶与溶质分子之间原则上不会发生任何作用,因此在一次分离后用流动相稍加平衡就可以运行下一次的色谱操作。但在实际应用中常有一定的污染物污染凝胶。对已沉积于凝胶床表面的不溶物可把表层凝胶曲调,在适当增补一些新的溶涨胶,并运行重新平衡处理;如果整个柱有微量污染,可用0.5molNaCl溶液洗脱。在通常情况下,一根凝胶柱可使用半年之久。
凝胶柱若经多次使用后,其色泽改变,流速降低,表面有污渍等就要对凝胶运行再生处理。凝胶的再生是指用恰当的方法除去凝胶中的污染物,使其恢复其原来的性质。交联葡萄糖凝胶厂用温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L的氯化钠和混合液浸泡,用水冲洗到中性;而对于聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶由于遇酸碱不稳定,则常用盐溶液浸泡,然后用水冲到中性。
7、保存
经常使用的凝胶以湿态保存为主,为了避免凝胶床染菌,可加少许氯仿、苯酚或硝基苯等化学物质,它可以使色谱柱放置几个月至一年。凝胶的干燥应先对凝胶运行浮选,除去细小的颗粒,并用大量水洗,除去盐和污染物,然后逐步增加一春浓度使凝胶收缩,在60~80度干燥,在整个操作过程中的蒸馏水、器皿和房间必须干净。琼脂糖凝胶的干燥操作比较麻烦,并且干燥后还不容易溶张,所以一般仍以湿态保存为主。
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